生体深部での観察が可能な近赤外光領域の蛍光を発し、がん治療の標的分子として注目される葉酸受容体を発現する細胞だけを検出できる蛍光試薬を開発した。
正常な生体組織への吸着を抑え、蛍光試薬の投与後わずか３０分以内で、はっきりとがん部位を蛍光検出できた。
培養細胞およびマウス摘出胚でも、選択的に葉酸受容体の発現を観察できた。


葉酸受容体注１）は、卵巣がんや子宮内膜がんにおける過剰発現やマウス胚注２）における神経管閉鎖部位での特異的な発現が報告されており、臨床医学および生命科学研究において重要な標的分子です。実際に近年、葉酸受容体の発現を可視化する蛍光注３）試薬を用いた臨床試験で、がん摘出手術中に目では見分けにくいがん部位を見つけるための利用が報告されています。また、がん治療における抗体の標的分子としても注目されています。

本研究グループは、動物体内で葉酸受容体を高発現しているがん部位を、短時間にはっきりと蛍光検出できる近赤外光領域注４）の蛍光試薬を開発しました。

この蛍光試薬を、葉酸受容体を発現しているがんを持つモデルマウスに静脈内投与したところ、わずか３０分以内ではっきりとがん部位を蛍光検出することができました。今までの蛍光試薬は、葉酸受容体が発現していない正常細胞にも吸着してしまうことが問題でしたが、葉酸受容体にだけ吸着する蛍光試薬を独自にデザインし開発しました。その結果、生きた動物において、葉酸受容体が高発現しているがん細胞の選択的な検出に成功しました。

また、迅速で高感度に葉酸受容体を蛍光検出できるため、葉酸受容体に関わる幅広い生命現象の観察にも利用できます。

今回開発した蛍光試薬を用いれば、手術中での小さながんの検出をこれまでより正確に測定することができるといった臨床医療に加え、生命科学の基礎研究にも貢献することが期待されます。

本成果は、国際科学誌「Ａｎｇｅｗａｎｄｔｅ Ｃｈｅｍｉｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｅｄｉｔｉｏｎ」のオンライン版で２０２０年１月２６日付で公開されました。


本成果は、ＪＳＴ 研究成果展開事業 先端計測分析技術・機器開発プログラム 開発課題「新規近赤外蛍光団の開発と実用的蛍光プローブの創製（チームリーダー：花岡 健二郎）」によって得られました。


＜発表内容＞


葉酸は、ヌクレオチド注５）やアミノ酸の生成原料であり、ＤＮＡやたんぱく質のメチル化にも関与する水溶性ビタミンの１つです。葉酸受容体はその葉酸を細胞内に取り込む役割を担うたんぱく質です。葉酸受容体の発現部位は、正常組織においては肺や腎臓、発生過程における胚、胎盤などに限られている一方、がん組織においては卵巣がんや子宮内膜がんでの過剰発現が報告されています。そのため、がん治療における標的分子の１つとして注目されています。また、葉酸は胎児の神経管形成注６）に関与していると報告されており、マウス胚においては神経管閉鎖部位での葉酸受容体の発現がｍＲＮＡ注７）レベルで検出されています。一方、葉酸受容体を発現している細胞を蛍光イメージング注８）によって検出する蛍光試薬は、近年手術中において目では見分けづらいがん組織を見つける技術として注目され、実際に臨床試験も行われています。しかし、既存の蛍光試薬は動物個体への投与後、標的がん部位を明確にするために、それ以外の部位に吸着した余剰な蛍光試薬が排泄されるまで、数時間から１日程度の長い時間待つ必要があることが問題でした（図１）。

そこで、蛍光試薬の正常組織に対する非特異的な吸着を抑えることで、蛍光試薬の排泄を待つ時間を短縮し、リアルタイムかつ高感度に蛍光観察ができると考え研究に着手しました。

本研究グループは、これまで多くの蛍光色素の開発に成功しています。その技術力をもとに、葉酸受容体に対するリガンドである葉酸とさまざまな蛍光団とを水溶性の高いペプチドリンカーで結合させた分子をデザイン、合成しました。培養細胞で評価したところ、正常細胞への取り込みが見られなかった近赤外蛍光を発する蛍光試薬、ＦｏｌａｔｅＳｉＲ−１を見いだすことに成功しました（図２）。また、その分子構造が類似した蛍光試薬であるＦｏｌａｔｅＳｉＲ−２をコントロール（対照）化合物として（図２）、さらなる評価を行いました。両蛍光試薬を葉酸受容体が過剰発現しているＫＢ細胞（ヒト口腔がん細胞）に応用した結果、ＦｏｌａｔｅＳｉＲ−１は細胞膜上のみから蛍光が観察されました（図３ａ）。また、この蛍光は過剰の葉酸による競合阻害によって消失したため、ＦｏｌａｔｅＳｉＲ−１は葉酸受容体を選択的に可視化していると考えられました。一方、ＦｏｌａｔｅＳｉＲ−２は細胞膜上の蛍光に加え、細胞内からも点状の蛍光が観察されました（図３ｂ）。この点状の蛍光は葉酸競合実験においても消失しないことから、一部のＦｏｌａｔｅＳｉＲ−２は葉酸受容体以外の細胞内部位にも取り込まれていると考えられました。

また、これら蛍光試薬をマウス胚の染色へと応用したところ、ＦｏｌａｔｅＳｉＲ−２においては胚全体から点状の蛍光が観察されたのに対し、ＦｏｌａｔｅＳｉＲ−１は葉酸受容体が高発現していると報告されている神経管閉鎖部位において強い蛍光が観察されました（図４）。また、ＫＢ細胞を用いたがんモデルマウスへと応用したところ、ＦｏｌａｔｅＳｉＲ−２は投与後６時間経過後も正常細胞への吸着に由来するバックグラウンド蛍光が観察された一方で、ＦｏｌａｔｅＳｉＲ−１はバックグラウンド蛍光の消失が早く、蛍光試薬投与後３０分以内に高感度でがんの蛍光観察が可能でした（図５）。

さらに、ヒト卵巣がんの凍結組織マイクロアレイへと応用した結果、正常組織サンプルからは蛍光は観察されず、葉酸受容体が発現したがん部位から蛍光を観察することに成功しました（図６）。

これらのことから、これまでの蛍光試薬の問題点を克服した高感度で葉酸受容体を発現した細胞を検出できる実用的な蛍光試薬であることが示されました。

開発した蛍光試薬を用いることで、手術中における目では見つけにくかった卵巣がんの蛍光検出などの臨床医療への応用が期待されます。また、蛍光試薬の投与後、短時間でがんを高感度で検出できることから、手術直前および手術中での蛍光試薬の投与ができる可能性があり、よりその応用範囲が広がると期待されます。さらに、生命科学研究では、マウス胚の神経管閉鎖部位における葉酸受容体の蛍光イメージングのように、葉酸受容体に関わる生命現象を明らかにすることができ、基礎研究においても有用なツールになると考えられます。

本研究の成果は、将来、臨床医療と基礎研究の両面において、その進展に大きく貢献することが期待されます。


引用元：
卵巣がんなどを短時間で高感度に検出できる蛍光試薬の開発(科学技術振興機構)